Οι τεχνικές που θα χρησιμοποιούν στην παρούσα Πράξη περιγράφονται συνοπτικά παρακάτω:
| Α. DNA barcoding: |  |
Στην τεχνική αυτή πραγματοποιείται πολλαπλασιασμός μιας μικρής περιοχής (barcode) του DNA ενός οργανισμού με την χρήση ειδικών εκκινητών ως προς το γονίδιο που εξετάζεται (με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης-PCR) και στη συνέχεια προσδιορίζεται η πρωτοταγής δομή του (sequencing). Η γονιδιακή περιοχή που χρησιμοποιείται ως πρότυπος γραμμικός κώδικας για όλες σχεδόν τις ομάδες ζώων είναι μια περιοχή 648 ζευγών βάσεων του γονιδίου της 1ης υπομονάδας της κυτοχρωμικής οξειδάσης (“COΙ”) που κωδικοποιείται στο ζωικό μιτοχονδριακό DNA.
| Β. FINS (Forensically Informative Nucleotide Sequencing) | |
Είναι μια τεχνική που βασίζεται όπως το Barcoding, στον πολλαπλασιασμό μια συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, προσδιορισμό της πρωτοδιάταξης και στη συνέχεια σύγκριση με γνωστές αλληλουχίες από τις τράπεζες δεδομένων και τη χρήση φυλογενετικής ανάλυσης για να εκτιμηθούν οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των αλληλουχιών. Το γονίδιο που χρησιμοποιείται ευρύτατα είναι το μιτοχονδριακό cytb ή τα: 12sr RNA, 16s rRNA ATPase 6 και η ρυθμιστική περιοχή D-Loop, τα οποία εμφανίζουν μικρότερη ομολογία αλληλουχιών μεταξύ των πληθυσμών του ίδιου είδους.
Γ. PCR–RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) – είναι μια πιο οικονομική και τεχνικά απλή εναλλακτική του FINS, η οποία χρησιμοποιείται εφόσον έχει καθοριστεί η αλληλουχία μιας περιοχής και απαραίτητη προϋπόθεση είναι η ύπαρξη σημείων πέψης από περιοριστικές ενδονουκλεάσες, τα οποία διαφέρουν μεταξύ του δείγματος αναφοράς και των άλλων δειγμάτων υπό έλεγχο. Το προϊόν της αντίδρασης PCR,
υπόκειται σε πέψη με το κατάλληλο ένζυμο και ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα αγαρόζης. Το πρότυπο των ζωνών που εμφανίζονται είναι χαρακτηριστικό για το είδος και επιτρέπει την αναγνώρισή του.
Δ. Multiplex PCR. Είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται εκτεταμένα για τον ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό πολλών αλληλουχιών στόχων σε μια αντίδραση PCR. Σε μια τέτοια δοκιμή χρησιμοποιούνται διαφορετικά ζεύγη εκκινητών, τα οποία θα πρέπει να είναι σχεδιασμένα να λειτουργούν στην ίδια θερμοκρασία υβριδοποίησης. Το πλεονέκτημά της είναι η μείωση του κόστους και η μεγαλύτερη αξιοπιστία λόγω της ταυτόχρονης εξέτασης πολλαπλών γενετικών δεικτών στο ίδιο δείγμα. Το πρότυπο των προϊόντων του PCR θα πρέπει να διαφέρει μεταξύ του δείγματος αναφοράς και των υπό εξέταση δειγμάτων.
Ε. Real time PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction–αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο). Στη μέθοδο αυτή πραγματοποιείται πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας σε πραγματικό χρόνο και παρακολούθηση της πορείας της αντίδρασης, λόγω της χρήσης φθοριζόντων μορίων. Ως στόχοι για τον πολλαπλασιασμό θα χρησιμοποιηθούν μιτοχονδριακά γονίδια σύμφωνα με τα αποτελέσματα από το DNA Barcoding και τη FINS (π.χ. COI, cytb, 12s rRNA, 16s rRNA, ATPase 6). Με την παρούσα τεχνική υπάρχει η δυνατότητα εντοπισμού διαφορετικών αλληλουχιών με τη χρήση κατάλληλα σημασμένων μορίων.
ΣΤ. HRM (High Resolution Melting) – κατά την οποία πραγματοποιείται πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας στόχος και στη συνέχεια τήξη του προϊόντος. Η θερμοκρασία τήξης (Tm) ενός μορίου DNA εξαρτάται από το μήκος και τη σύσταση της αλληλουχίας του σε γουανίνη G και κυτοσίνη C (GC content) και διαφέρει ανάλογα με τη σύσταση της αλληλουχίας που ελέγχεται. H παρακολούθηση της πορείας της αντίδρασης γίνεται με τη χρήση φθοριζόντων χρωστικών, που δίνουν τη δυνατότητα διάκρισης ακόμα και σε μικρές διαφορές μεταξύ των αλληλουχιών. Θα χρησιμοποιηθούν ως στόχοι για τον πολλαπλασιασμό περισσότερα από ένα μιτοχονδριακά γονίδια (COI, cytb, 12s rRNA, 16s rRNA, ATPase 6) όπως προαναφέρθηκε.